[求救] western同一片膜但背景有些髒有些乾淨

[kyuxi0203 (tiffany)]

各位前輩好，最近在做western上遇到了一些問題，想請各位幫幫忙

步驟如下：
running:上膠80 V, 50 min，下膠：130 V, 120 min
transffering:400 mA, 2 hr
blocking: 5%脫脂奶粉, 1 hr
wash三次十分鐘後裁膜加一抗overnight，
隔天回收一抗，wash三次十分鐘加二抗室溫一小時，
再wash三次十分鐘，UVP拍照
這時就出現了同一張膜有的抗體背景乾淨，有的卻很髒，
不知道前輩們是否能幫忙troubleshooting，謝謝！
https://imgur.com/8h3kZt6

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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1629290849.A.4C1.html
→ blence: 下次兩片membrane用同一支抗體再來比較背景
推 tynse71864: 同上，但八成只是上面那隻抗體就是髒...
推 r03b43022: 1.同張膜的話，哪一個是stripping 後的（stripping不乾
→ r03b43022: 淨）？還是位置不同（裁切）2.標的、抗體稀釋倍率？（
→ r03b43022: 可能目標弱，成色時間拉長背景跟著上升）3.增加wash 次
→ r03b43022: 數，每次wash時間縮短4.確保二抗新配5.有的一抗會因為
→ r03b43022: 壓的次數增多而變乾淨（非專ㄧ訊號隨壓的次數增加而減
→ r03b43022: 少）
1. 位置不同
2. arg-1 1:1000

因為訊號比較弱所以把二抗從1:10000調整到1:5000
※ 編輯: kyuxi0203 (101.9.172.69 臺灣), 08/19/2021 08:44:05

※ 編輯: kyuxi0203 (101.9.172.69 臺灣), 08/19/2021 08:45:48
→ blence: 一抗濃度,時間可以改,蛋白量可以調整,曝光時間也可以拉長
→ blence: 甚至ECL還可以換更靈敏的,唯獨二抗條件最沒更動需求
推 waveking: 覺得比較可能是blocking buffer 有沉澱出問題，建議配完
→ waveking: 奶粉的時候過個PES 0.22膜
推 r03b43022: 也可以改用3% BSA blocking試試，盒子也要注意乾淨
→ blence: 用0.22 filter去過milk是認真的嗎？
→ xxtomnyxx: 他大概不知道牛奶的組成吧www
→ xxtomnyxx: 離心就好，順帶一提，關於這個部分，其實我最近手上有
→ xxtomnyxx: 些有趣的結果ww
→ williamyang: 單純是上面抗體很髒,有品牌貨號或許有機會幫你解決
感謝各位的幫忙~ 配了新的之後好很多了!

※ 編輯: kyuxi0203 (101.9.49.253 臺灣), 08/20/2021 18:04:28