[求救] 免疫沉澱（IP)問題

[dawnga (Dawn)]

前輩好
最近要做IP後跑western ，實驗室以往沒有做過沒有人可以詢問，所以研究有些吃力，研
究許多protocol 後，有問題幾個問題想請教前輩。


先簡要敘述步驟：

蛋白定量後的樣品與（1.適量一抗）混合overnight,隔天加入活化後beads 約兩小時抓下
抗原抗體，（2.清洗）後離心留下沈澱物，加入（3.sample dye) 30uL，加熱95度/5分鐘
，完成。


請問前輩
1. 適量一抗一般標準是多少，第一次做該如何決定？

2. wash 沈澱物步驟，實驗室beads的datasheet 中寫「water」，我覺得有些奇怪，也有
看過中文論文以RIPA buffer 及 wash buffer ，不知何者較常見？

3.沈澱物加入30uL sample dye，所有的中英protocol 都這樣寫。我有一些疑問,以下有
四：

a. 所以sample 最後只有30uL 嗎？！ 這樣不是很濃嗎！跟先前定量的感覺也沒有關聯呀
？

b. 之後跑western 膠要load多少量呢？

c. Beads 是不是也在dye裡 ，也會被load進去嗎......

d. sample dye(6X)  應該要先稀釋成1X再加入30uL 嗎？


先謝謝前輩指教了！

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 49.217.136.33 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1629520890.A.666.html
推 soend: 實驗室之前有做過western嗎？
推 soend: 如果沒有，建議你先研究western 的原理，IP只是樣本前處理
→ soend: 不同而已
有做過，我會再多了解！

08/21 19:55
推 CSFV: 珠珠load進去沒關係，會卡在well裡面，不會跑進膠裡面
→ CSFV: 之前做完IP要拿去打質譜前是這樣弄的
好的！了解 謝謝
08/21 21:52
→ blence: IP抗體用量看datasheet,或參考abcam "Unpurified antibody
→ blence: concentrations"有相關的用量介紹
→ blence: 原則上wash會是PBS不是水,通常是當初用的lysis buffer或去
→ blence: 除detergent成分的buffer等,像是CSK buffer
→ blence: RIPA不適合在coIP或一般IP當wash buffer使用
→ blence: 多數IP能抓的是原本lysate的10~20%的蛋白,太多sample dye
→ blence: 沒必要,以30ul來說,剛好可以跑1次膠跟保留1次repeat機會
謝謝您的詳細解說，跟您確認一下我的理解是否正確！ 所以我原先認為只有30uL會有很
濃度蛋白是不對的想法，因為IP後的蛋白可能剩不到兩成，所以跑膠時load量仍跟平常差
不多（10uL/well)嗎
※ 編輯: dawnga (49.217.3.144 臺灣), 08/22/2021 16:16:45
推 soend: 建議跑IP之前，先測試該細胞裡你想要抓的蛋白的表現量，這
→ soend: 樣才有辦法決定你要下多少蛋白量去抓。一抗要買有標可以IP
→ soend: 的抗體，濃度可以先參照上面寫的。至於要loading 多少量，
→ soend: 也是參照表現量而定。就像前面說的，可以抓下來的量可能很
→ soend: 少，你如果還loading很少，可能也無法被偵測到。假設protoc
→ soend: ol 是建議用30ul去煮，通常就是全部loading 進去（使用大
→ soend: 的well),你說的10ul/well,應該是小的well
謝謝！！我這幾天很忙碌沒有時間回覆，感謝你的幫助，我有成功哦
推 tynse71864: 1. 一般第一次我會用 1ug 抗體去抓  沒濃度的話用 1ul
→ tynse71864: 2. 我一般用 2x sample elution , 效果會比一倍的好 (
→ tynse71864: 我同學也有人用 5X的，只是很難 pipet)
謝謝！我跟您一樣使用兩倍所以成功了，但是請教一下，一倍效果不好會看到什麼狀況嗎
？
→ blence: bead體積殘餘的wash buffer不管再怎麼處理都不能完全去除
→ blence: 所以放1x elution一定會稀釋,效果想必不好
了解了  謝謝您～
→ xxtomnyxx: 抗體用量建議做個titration，bead其實有一種filter
→ xxtomnyxx: column可以把elution buffer 和 bead 分開，通常加了多
→ xxtomnyxx: 少bead我就當作他體積有多少(就算是slurry也一樣)，然
→ xxtomnyxx: 後用那個體積去回推要加幾倍的sample buffer。
→ xxtomnyxx: Wash buffer要用什麼其實很不一定，看你實驗的目的決定
→ xxtomnyxx: ，如果你只是要抓target protein，wash可以用比lysis
→ xxtomnyxx: buffer更強的(如NaCl濃度提高)去洗，但是如果你是要抓
→ xxtomnyxx: 其他和target protein在一起的蛋白質(也就是其實是做
→ xxtomnyxx: co-IP)，通常就是直接用lysis buffer去洗，而且lysis
→ xxtomnyxx: buffer不會用到RIPA，通常是用triton或NP40這類不會破
→ xxtomnyxx: 壞蛋白質構型的兩性分子配製lysis buffer。
謝謝您的詳細說明～這幾天有點忙沒有時間回覆，非常感謝你的幫助，我有成功哦，而且
得到了很多小知識，這個實驗室只有我一個人，所以在學習上有些辛苦（汗
→ ad1980: 同前面推文說的，通常是用之前的 lysis buffer 洗，然後 3
→ ad1980: 0 ul beads 我是用 30 ul 2X sample buffer，煮了以後 spi
→ ad1980: n down beads，如果不想 load beads 到 wells 裡，可以用
→ ad1980: 細長的那種 gel loading tips。
謝謝你的說明，很詳細讓我完全了解，不會不知道自己為什麼這樣做！
※ 編輯: dawnga (49.217.0.206 臺灣), 09/12/2021 10:32:50