[討論] 點突變如何成功

[nm768417 (opport)]

小弟使用PCR進行點突變
目標是改為下圖的大寫GCC
https://i.imgur.com/T3iWSFN.jpg

實驗流程是PCR進行點突變，利用設計好的兩個引子，會擴增出帶有目標區域的質體，接
著使用DpnI進行消化，消化掉帶有甲基化的質體股

PCR program：
95 蚓             5 mins
95 蚓             30 sec
55 蚓             30 sec   用的是CloneAmp HiFi premix
68 蚓             3 min 30  protocol提供的溫度參考
68 蚓             7 mins
25 蚓             1 mins

引子的黏合溫度 軟體是估60.6
不過學長覺得可能亂黏 就改成55了

引子當初設計的時候全長為26
Forward Reverse為互補

DpnI消化O/N

是由於引子長度太短導致黏不上嗎
還是TM值抓的太低
小弟能想到的只有這兩個可能性

最後都有去做定序
都沒有挑到成功的

希望各位高手大哥大姐們 多多指教

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.117.70 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1631603886.A.7B0.html
推 darrenyo: 問題是什麼? 菌不長? 挑出來不對? 還是根本沒P出東西
→ blence: 既然有學長就請學長來解決了
推 osla30: gcc是要改成什麼?用backtoback比較容易...
※ 編輯: nm768417 (1.165.158.144 臺灣), 09/14/2021 23:50:52
推 CSFV: annealing溫度調低一定接得上吧？倒是可能增加非特異性結合
→ CSFV: 的機率，primer設計阿肥乍看之下沒什麼問題，硬要說的話3'
→ CSFV: 那邊可以再少一個T，點突變兩側GC比例高一些會比較好接上去
→ CSFV: 是說DpnI切O/N不會太久喔？現在幾乎都time-saving，15分鐘
→ CSFV: 就搞定，阿肥頂多給他切到一個小時，切久好像容易出事
→ Ice9: template上是GCC, 設計的 primer也是GCC。這是有改嗎？
→ CSFV: 我預設原po是不小心打錯，實際上有改XD
→ nm768417: 應該說引子是GCC 所以模板預測出來是GCC 上面的圖片是
→ nm768417: 成功後出來的預測結果
推 osla30: 所以原本究竟是什麼？要改成GCC
→ nm768417: 原本是R
推 ad1980: 你的 vector 是 3.5kb？
推 bob79620: Dpn-1切O/N ？ 怪不得沒東西
推 aeroufo: 左右邊各延長到17mers，Dpn-1切1小時就夠了
→ Ice9: 可以考慮再繼續降到 52度試試。另外，原質體取自何種菌？新
→ Ice9: 質體又用什麼菌？