→ Ice9: 小鼠的變異很靠3'端啊，你怎麼會覺得沒問題？甚至有三個變 10/19 00:54
→ Ice9: 異的 10/19 00:54
→ xxtomnyxx: 找出轉殖鼠有無攜帶人類基因？那為什麼要能同時放大老 10/19 02:55
→ xxtomnyxx: 鼠的？這樣如果有產物你要怎麼分是放大到人類的還是老 10/19 02:55
→ xxtomnyxx: 鼠的基因片段？ 10/19 02:55
推 camphor0614: 有mismatch的primer需要更低的annealing溫度，PCR條 10/19 07:30
→ camphor0614: 件58C 15sec夾不到就再降溫度，56C、54C、52C、50C 10/19 07:30
推 camphor0614: 另一個方法則是重新設計Primer，盡量找完全match的， 10/19 07:41
→ camphor0614: 再不然match最多只集中在5'端5個mer。 10/19 07:41
推 taya1991: 目標是確認轉殖鼠有沒有目標人類基因………那你就設計夾 10/19 07:51
→ taya1991: 那個基因的primer啊？人的DNA是...positive ctrl? 10/19 07:51
→ blence: 別調整了,你的PCR結果已經說明這老鼠帶有人的轉植基因了 10/19 08:23
→ pent: 我需要同樣可已看到老鼠wildtype的 10/19 09:11
※ 編輯: pent (223.136.150.94 臺灣), 10/19/2021 09:16:37
※ 編輯: pent (223.136.150.94 臺灣), 10/19/2021 09:18:00
→ blence: primer在mismatch的位置設計成degenerate code 10/19 10:39
→ xxtomnyxx: 我來做的話，如果可以找到 >20 bp 人類和老鼠完全相同 10/19 13:13
→ xxtomnyxx: 且適合作為 primer 的序列，只需要一個這樣的區域設計 10/19 13:13
→ xxtomnyxx: primer 1，然後人類和老鼠各設計一條 primer 2-1 和 p 10/19 13:13
→ xxtomnyxx: rimer 2-2，且人類和老鼠的PCR產物大小不同可以跑膠分 10/19 13:13
→ xxtomnyxx: 辨，以後GT就3條 primer 丟在一管一起做PCR，然後可以 10/19 13:13
→ xxtomnyxx: 跑膠看出是M/M、H/M或是H/H。如果都找不到共同>20 bp 10/19 13:13
→ xxtomnyxx: 可設計的序列，就直接設計2對primer分別做人類和老鼠 10/19 13:13
→ xxtomnyxx: ，只要設計的夠好4條丟同一管做也不會有影響 10/19 13:13
→ Ice9: 對了，不考慮加一個 positive control? 10/19 16:09
推 agagy: 向樓上說的設計人鼠2組就好啦，為什麼要複雜化 10/19 22:52
→ agagy: 不然就像另外2位說的，人鼠都能P到那你怎麼知道是人還是鼠? 10/19 22:53
→ agagy: 要分出人鼠的話也要像xx說的那樣設計三條來配對吧 10/19 22:55
推 gisk: 用qpcr去算插入基因的copy number ->成功拜託跟我說一聲 10/20 19:08
→ xxtomnyxx: 我覺得我大概猜到你們想幹嘛了，之所以要設計人類老鼠 10/21 22:17
→ xxtomnyxx: 都能做的 primer，是為了用WT老鼠本身帶有的2個allele 10/21 22:18
→ xxtomnyxx: 去當做標準，然後用qPCR算TG數比WT多帶了幾個copy吧？ 10/21 22:19
→ xxtomnyxx: 首先.....這種做法必須要保證primer在人類老鼠都有100% 10/21 22:20
→ xxtomnyxx: 的序列，否則就會因為有mismatch造成放大效率不一，然 10/21 22:20
→ xxtomnyxx: 後即使primer binding site序列完全一樣，人類老鼠PCR 10/21 22:21
→ xxtomnyxx: 產物的序列不同也就有可能影響放大效率了，primer也不 10/21 22:22
→ xxtomnyxx: 能用前幾樓提到的degenerate code去做。總之，只要你沒 10/21 22:22
→ xxtomnyxx: 辦法在人類和老鼠上找到完全一樣的兩個可以設計primer 10/21 22:23
→ xxtomnyxx: 的區域，那就不用想用這個方法去算copy number了 10/21 22:23
→ pent: 感謝，有相關paper。 10/22 13:38
推 kohinoor: 如果用三個引子就能p到野生型，兩個(ab)在插入片段的上 03/23 07:51
→ kohinoor: 下游，一個在拆入片段中(c)。野生型是ab出來的片段，有 03/23 07:51
→ kohinoor: 插入序列的是ac 讓ab和ac長度不同 03/23 07:51