[求救] qPCR DDW有值

[Netline (沒有錢)]

如題，雖然網路上很容易就能找到一堆文章
但照做以後都沒改善，找原因找到快發瘋QQ

因為身處老闆比我更不認識生科技術的環境，小妹又才疏學淺
希望板上大神不吝指教orz

qPCR目標基因分別是動物性基因12S跟植物性基因5.8S
使用Qiagen QuantiNova Porbe PCR kit跑40cycles

跟protocol不一樣的是
原廠是建議primer.probe最終濃度0.4μM及0.2μM(duplex分別的濃度)
而實驗室目前使用最終濃度為0.7μM及0.2μM(singleplex)
猜測是前人立方法的時候覺得我們只跑一個基因，下濃一點也沒關係（？）
但這不知道會不會影響？

水的出值從Ct36-39不等，偶爾也會未檢出
目前做過的改善：
pipette拆卸清理，用DNase擦過
primer.probe重配、水重新滅菌
qPCR儀器光學校正

也有想過人員污染，畢竟人就是動物
但現在的情況是植物性基因光P水也會有值………
實在是不曉得哪裡還會污染到QQ 希望能夠指點迷津

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.72.68.233 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1660184913.A.C3A.html
→ xxtomnyxx: 如果植物性的基因也有Ct，那就未必是污染
→ xxtomnyxx: 我個人會嘗試降低 primer&probe 的濃度，尤其是當有加
→ xxtomnyxx: 入template的時候Ct都很低的狀況(<25，<20尤佳)
→ xxtomnyxx: 做實驗有一個觀念，所有的反應都與濃度和溫度有關，就
→ xxtomnyxx: 算是理想上不會發生的反應，只要反應物濃度夠高也會發
→ xxtomnyxx: 生
感謝回覆！
有加入template的正反應Ct都落在16-18左右
會再跟老闆討論看看，是否可以往這個方向走

現在就是被覺得學理上就算primer.probe濃度比較高也不會影響反應
畢竟沒有的東西就是該沒有
雖然也知道這邏輯，但畢竟濃度高了兩倍感覺變因還是很多 囧

推 jabari: Ct36-39就當NTC cut off不就好
→ xxtomnyxx: 如果你有加template的樣本從來沒有超過 25 的 Ct ，那
→ xxtomnyxx: 把 >35 的通通當 negative 就好，只是萬一有出現 Ct 在
→ xxtomnyxx: 30 上下的樣本就不好判讀了
其實我們目前就是把Ct35當判定界線沒錯
但就是被老闆問為什麼水會有值…… 囧
自己以前的學術經驗沒人會在意Ct值這麼後面的東西
但老闆就覺得這樣不是辦法（？）於是上來討教QQ

→ jabari: 通常DDW有的話 就是probe品質撐不過你的cycle數 水解了
→ jabari: 你probe下濃的話 水解掉的量就高 所以CT 36就有. 你還不
→ jabari: 如拿跑完的產物跑電泳 看有沒Band
實驗室沒有電泳設備（跪）
不然已經想跑膠肖想很久了……
水解的問題我沒想過會影響到，感謝思路！
※ 編輯: Netline (118.160.140.220 臺灣), 08/11/2022 23:35:04

推 Ice9: 自從知道有 eDNA的檢測和應用之後，我就放開疑惑了。
環境DNA四處都有就let it go的意思嗎？XDDD

→ gundamhaha: 沒確定沒污染的話就降低primer濃度，縮短annealing時
→ gundamhaha: 間。根本方法是調整序列
會再來試看看的！

推 MartianIT: DDW Ct36-39的曲線長怎樣? 如果不是sigmoid曲線(e.g.
→ MartianIT: positive control那種) 而是訊號慢慢增加上飄 應該就是
→ MartianIT: 雜訊了 最可能的是probe水解掉了
是那種明顯指數增長的曲線
之前也遇過如您敘述的訊號上飄，重配後就有解決

推 BGG: 建議可以找 QIAGEN 專員討論
更新一下，也謝謝幾位先進的解答
目前做起來比較穩定了，貌似primer真的太濃啦～～
※ 編輯: Netline (223.138.117.94 臺灣), 09/02/2022 13:46:32