[求救] colony PCR p不出insert

[ntuiob110 (芸)]

各位版友好，第一次發文，如果有什麼格式不合還煩請提醒，謝謝大家

我的plasmid是以Gibson Assembly 組合insert 跟 pUC 的vector，之前藍白篩有成功轉入E. coli XL1-blue，從其中抽plasmid出來，想再轉入 E. coli DH5A 跟BL21(DE3)分別做保存跟表達，以colony PCR快速篩選Transformation 菌盤上的菌卻一直無法得到目標基因。

colony PCR有以之前抽取所得plasmid另外做一個正控制組，有得到目標基因。

transformation的實驗流程如下：將competent cell置於冰上解凍，注入5% plasmid DNA後，震盪一秒、放在冰上5分鐘，再以42°C heat shock 30sec，塗到LB/Amp plate上養overnight。
（以上流程都是參考自competent cell廠商提供的protocol)

transformation時也有塗沒有plasmid的組別做為負控制組，也如預期沒有長菌落

目前個人覺得會是colony中的plasmid 沒有insert，之後會想同一colony 以目標基因的primer跟AmpR的primer去跑colony PCR驗證

不知道版友們有沒有什麼其他的建議？謝謝大家

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推 jabari: 重做
→ rebirth: PCR 有positive control and negative control? 如何判
→ rebirth: 斷沒有insert？ 另外看敘述應該是plasmid transformatio
→ rebirth: n. 有沒有考慮直接抽plasmid (DH5a)做RE check?
→ blence: 為了保存或表達的re-transform會需要用colony-PCR來驗證真
→ blence: 偽,那代表在XL1-blue階段做的colony-PCR就是錯的
推 darrenyo: 我自己做的話, 會在藍白篩完再挑菌做colony pcr或者抽p
→ darrenyo: lasmid digestion擇一, 有對的話再送一到兩個plasmid去
→ darrenyo: 送定序確認, 定序對了之後re-transform照理說全部都會
→ darrenyo: 是你要的plasmid不太會有別的, 就不太會特別去check了
→ ntuiob110: 後來發現colony PCR NEB有專門的kit，我的colony PCR
→ ntuiob110: 指的是直接勾菌落跟NEB Q5 High Fidelity DNA Polymer
→ ntuiob110: ase 去跑PCR
→ ntuiob110: 可能會試試RE去digest 從藍白篩那邊抽出來的plasmid
→ ntuiob110: 是不是我預期的長度，謝謝樓上各位大神的指教了
→ xxtomnyxx: 用 Q5 HF 做 colony PCR.....好闊的實驗室啊！
推 Ianthegood: q5極挑template neb的onetaq就便宜大碗 colony pcr常
→ Ianthegood: 批不出來的原因是菌下太多 我會先在另一個plate上面
→ Ianthegood: 捅一下把太多的菌抹掉再進mix
推 Ianthegood: 如果一定要用hf taq做colony pcr 我建議phusion或是一
→ Ianthegood: 個新東西叫repliqa toughmix 然後一開始要記得熱3分
→ Ianthegood: 鐘破菌
→ xxtomnyxx: 我也是投拿你之前抽的去切 RE 一票，然後想問問：你具
→ xxtomnyxx: 體來說是拿了幾 ng 的 plasmid DNA 去 transform？長出
→ xxtomnyxx: 的 colony 大概有多少？
→ a90648: 從藍白篩抽出來的開始確認吧，感覺那邊就錯了
→ ntuiob110: 我是取795.85 ng的DNA去transformation，長出來的菌落
→ ntuiob110: 約900多顆
→ TrueTomny: 你的transform菌液是全部拿去塗盤還是只取部分？我如
→ TrueTomny: 果拿純化的plasmid用你說的那個量做transform，菌會直
→ TrueTomny: 接長成一片膜蓋滿整個盤子完全沒辦法算，只有長900多
→ TrueTomny: 顆我覺得太少了，應該是有問題
→ Ice9: Insert 多大？怎麼來的？
推 ysfang623: colony PCR很吃挑菌的手感，建議養液體過夜再取1ul進
→ ysfang623: 行PCR