[求救] stable transfect的螢光表現

[belzy (zy)]

Transfect新手研究生

要做overexpressed stable cell line，Insert 後面接紅色螢光當標記（有IRES也有直接
做fusion的組別)
之前有先測試g418的濃度（800ug/ml)

現在遇到的問題是，在篩選之後有一些不會表達螢光的細胞長得很好，跟有螢光的混在一起
分不開，是因為我一開始篩選的時候細胞不夠散嗎？

分盤之後再篩，沒有螢光的依然長得很好，已經會長得很均勻而不是團塊的樣子，還是沒辦
法只把有螢光的細胞分出來

想請問那些沒有螢光卻活下來的細胞，是螢光的promoter沒有被推動但是g418的promoter有
，還是篩出了有抗藥性的細胞？？還是其他原因？

還想請問我現在這個狀況有什麼補救的方法嗎？

感謝各位前輩們
在stable cell line卡好久卡到想休學了…orz

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推 ysfang623: 先抓瞬轉的條件，看多少DNA可以表現最多的螢光，抗生
→ ysfang623: 素晚一點再下
→ xxtomnyxx: 你的「篩」指的單純用藥殺還是有挑從1顆細胞長出的細胞
→ xxtomnyxx: 群把它分離出來單獨培養？
→ xxtomnyxx: 你用的 vector 是什麼？ pEF1 嗎？用 dual-promoter去
→ xxtomnyxx: 分別表現 GOI 和抗藥基因的vector的確會有GOI的promote
→ xxtomnyxx: r被關掉了但抗藥基因的promoter仍持續表現的問題
推 showwhale: 我們以前也遇過這種事 當時解決方法就是sorting