[討論] 連猴子也懂得PCR原理(?)

[Reflection11 (反思自省很困難)]

看到版上有不少人在問,想想也該發篇大家都懂通俗點的科普文章比較好

PCR簡單來說就是個複製 DNA的技術
假如DNA序列是本超厚的教科書(模板),而考試內容是考這本書的內容
你想要把要考的重點抄下來 (DNA聚合酶)
但你他媽的根本不知道要抄三小,沒人跟你說要從哪開始抄
所以需要一個導引,告訴你從哪開始
這個導引就是引子 (Primer),它告訴你從哪開始抄
知道後,你就拿著原子筆開始抄下來,而墨水就是核苷酸 (ATCG)

那一個複製DNA的技術怎麼用來檢驗呢?
假如今天你要抄寫朱自清的背影(檢驗目標,像是某種病毒)
你的引子可能是開頭
"我與父親不相見已二年餘了，我最不能忘記的是他的背影"
所以理論上你是要抄下有這段話的文章
但今天你拿到的書(檢體)是"連猴子都懂得神經解剖學"
你拿了這段引子對照了整本書,你他媽的還是不知道要抄啥
所以沒抄寫出東西(沒擴增),所以你知道這本書沒有你要的東西

大GUY4醬
不過這是複製 DNA,如果是要檢測 RNA,像是這次 SARS-Cov 2是RNA病毒
就必須要先逆轉錄 (Reverse transcription, RT)
把 RNA轉成 cDNA,你的 DNA聚合酶才懂
當然也是有能直接擴增 RNA的檢測技術像是 NASBA, TMA
不過就不說惹
有想問的我再補充

推文問到怎麼知道有沒有擴增,這邊就講一下 Real-time PCR
原理跟PCR一樣,不過多了點東西
以常用的 TaqMan probe為例,這是一種探針
探針跟引子很像,是一小段序列 (寡核苷酸),可以互補結合在 Primer之間的模板序列
不過這個探針兩端各加了兩種東西
(1) 螢光基團 (Fluorophore)
(2) 淬滅基團 (Quencher)
一開始時, Quencher會藉由 FRET(一種能量轉移形式)
抑制 Fluorophore發出螢光
但當 DNA聚合酶在複製延長時
會藉由 5'-3' Exonuclease活性,把擋在路中間的探針給分解掉
當分解掉後, Fluorophore和 Quencher之間的距離拉大分開了
此時就能順利激發出螢光,並能被偵測到
就能知道有擴增出東西來
https://imgur.com/nsZQxHH
(https://en.wikipedia.org/wiki/TaqMan)

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 61.230.160.66 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/nCoV2019/M.1581956654.A.73B.html
推 james732: 想請問是怎麼判斷有沒有擴增的呢？謝謝
推 bluecsky: 跑電泳
→ james732: 話說我google之後看不懂real time的差別
※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 00:55:04
推 jack82822005: 怎麼判斷擴增呢？電泳可，real time
→ jack82822005: PCR可以邊做邊看有沒有擴增
→ jack82822005: real time RT-PCR就是目前的做法
→ jack82822005: real time Reverse Transcription P
→ jack82822005: PCR
推 james732: 感謝!!
推 dragon49: real time就是你在做反應的時候就可以知
→ dragon49: 道他有沒有在擴增了 所以叫即時的 一般p
→ dragon49: cr你要反應完跑電泳才知道
→ james732: 原來差在這裡，這樣講我就懂了
推 gps0110: real time 就是有一個螢光的dye 當它bind
→ gps0110: 到雙股DNA時訊號會放大。這樣的話你就可
→ gps0110: 以"real time” monitor PCR的過程。
推 jack82822005: 樓上晶晶體(X XDD
推 gps0110: 生物出國才開始學很多中文不知道怎麼說
→ gps0110: sorry 囧
→ watase124: 正常啦 跟教授討論也是中文+英文
推 vpp90417: 生科不可避免的晶晶體
推 jack82822005: real time 簡單說就是在複製DNA的
→ jack82822005: 時候，成功複製出來的DNA會有螢光
→ jack82822005: ，所以如果檢體有病毒的核酸，隨著
→ jack82822005: 複製的循環越來越多次，反應液就會
→ jack82822005: 越來越亮。機器可以偵測亮度的變化
→ jack82822005: ，另外，如果循環個幾次就偵測到訊
→ jack82822005: 號，那就可以間接推論原本的病毒濃
→ jack82822005: 度比較高；反之循環到快三十次才偵
→ jack82822005: 測到亮光，那就是病毒含量比較低
→ jack82822005: 以上
推 james732: 感謝樓上與每位回覆的專家
→ james732: 其實我google很久但沒基礎實在看不懂...
→ jack82822005: 希望有幫助XD
→ jack82822005: 有問題可以再問
推 james732: https://i.imgur.com/ZwQWlQL.png
推 watase124: CDC 是重複 45 cycle 檢測方法有公布
→ james732: 這個表就是所謂的引子(Primer)嗎？
→ watase124: 雖然寫的蠻簡單的就是了 XD
→ james732: 出處: https://tinyurl.com/ufb2ytm
對,沒錯~那一些 Sequence就是 Primer
※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 00:56:55
→ james732: 謝謝原PO的回答!!
歐對,你貼的那張圖中,有些 Sequence頭尾寫的 FAM和 BBQ
就是 Probe的 Fluorophore及 Quencher
※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 00:59:57
推 james732: 正想請教說為什麼會跑出ATCG以外的東西
推 mgx1024: 有些非 ATCG 是 degenerate primer
推 gps0110: 你看最後是F跟R的就是用SYBR的 primer 如
→ gps0110: 果是P的就是R大內文裡面提到的probe
推 james732: 這篇獲益良多，謝謝大家回答
推 gps0110: 另外推R大的比喻
推 duriamon: 其實依照目前的檢測方法就不要太期待準
→ duriamon: 確度，病毒的RNA序列如果出現變化，現在
→ duriamon: 用的primer就可能會沒效。在加上從病人
→ duriamon: 檢體這樣的複雜的樣品要萃取RNA然後還要
→ duriamon: 用RT轉，過程中很多地方可能會出錯。所
→ duriamon: 以我覺得現在很多人一直吹，其實意義不
→ duriamon: 大。反而用抗體來檢驗，可能藉由蛋白質
→ duriamon: 的功能保留性來維持較久的準確度，例如
→ duriamon: 常提到病毒的Spike蛋白質因為要去抓人類
→ duriamon: 細胞的ACE-2蛋白質才能感染，所以那段關
→ duriamon: 鍵的蛋白質序列，其變化理論上不會太大
→ duriamon: 。
推 jabari: https://youtu.be/FpxwJNNufko 一起唱
對了,這篇文能直接轉八卦嗎,想說好不容易想的比喻(?)想讓多點人了解
※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 01:24:42
推 ekgs: 我是猴子 我看懂了 讚
→ watase124: PCR 之歌 以前當 TA 都會放給醫學系大
→ watase124: 一還大二的聽 XDD
推 watase124: 要用抗體抓 抗體專一性很重要 不好的
→ watase124: 可能抓出一堆雜 band 那也有得搞了 各
→ watase124: 有優缺啦
推 duriamon: 現在的問題是連美國CDC都還沒來得及去驗
→ duriamon: 證這個方法的準確性。
推 duriamon: https://s.yam.com/6aGbR
推 yoyo095235: 你這篇害我回到大學的痛苦時光
推 yoyo830917: ㄎㄎ的日常
推 Julibea: 推比喻淺顯易懂XD
推 cruby841031: 生科推
推 thevoidfancy: 對不起我們都只用sybrGreen
→ thevoidfancy: Taqman法實在太高大尚~
推 jonsauwi: PCR之歌經典 XD
推 chungrew: 幫推
→ jonsauwi: 上面說抗體抓出雜band，PCR也有一樣的問
→ jonsauwi: 題，而且就算primer設計在專一序列，
→ jonsauwi: anealing溫度沒設定好一樣會有偽陽性
→ jonsauwi: 而且PCR的偽陽性應該比免疫偵測高，畢竟
→ jonsauwi: 是放大再放大，做錯了一樣放大
→ jonsauwi: 不過偽陽性是可以接受的，比起錯放，寧
→ jonsauwi: 可有偽陽性
→ jonsauwi: 免疫偵測法的問題主要不在專一性，而是
→ jonsauwi: 它的偵測極限終究比不上PCR
推 CHY5566: 蛋白質專一性結合的問題很大呀，有做過We
→ CHY5566: stern blotting就知道了
推 CHY5566: PCR的準確率比較高，尤其病原體的基因和
→ CHY5566: 人的差異這麼大，primer的設計簡單又快速
推 rasaze: 講得不錯 推
推 hwider: 先推
推 Han831: 講的比老師說的還要聽得懂..推推
推 dearevan: 推
→ batatas: rtpcrq的偽陽性比較低啦 因為還要taqmam
→ batatas:  probe接的上去
→ batatas: 要更保險就產物拿去定序
推 s505015: Western blot 會很髒 麻煩
※ Reflection11:轉錄至看板 Gossiping                               02/18 17:36
推 adimsc: 我好懷念PCR之歌XDDD
→ adimsc: qPCR準確性我覺得真的比ELISA高，且需要
→ adimsc: 的時間基本上也比較少，只要有好的primer
→ adimsc:  +probe就很好用