[討論]簡介一般快篩原理與ELISA

[Reflection11 (反思自省很困難)]

RT-qPCR為目前認可的唯一檢測方法，大概的原理猴子那篇文也介紹了，雖然靈敏度
和偵測極限都很優秀，但畢竟檢測負荷量有限，未來疫情擴大發展為社區感染
不可能第一時間都做，需要發展快速檢測及快篩

首先先來介紹一下 甚麼是抗體 (Antibody, Ab)和抗原 (Antigen, Ag):
當身體有非我族類的外物進到身體 (病原體或花粉塵蟎之類的過敏原等..)
這些東西被免疫系統認為是種抗原
並會產生對抗這種抗原的專一性抗體,可以結合上抗原的表位 (epitope)把它給清除掉
https://imgur.com/T4FzHbi
(https://tinyurl.com/sjr9jjl)
一個抗原可能有很多種表位，所以會產生數種結合不同表位的抗體
第一次碰到的抗原，身體得要花4~7天產生初步的抗體
這個抗體是 IgM,過一段時間後(數個禮拜)， IgM逐漸減少，經類型轉換及親和力成熟轉為
分泌 IgG/IgE/IgA
IgG是人體最主要的抗體、 IgE和過敏有關、 IgA可以附著於黏膜(呼吸道,腸道)
中和病原體、毒素等物質。
https://imgur.com/E9gyzJs
(https://tinyurl.com/seh7adl)
當下一次遇到同樣的抗原,可以快速產生 IgG清除感染。

甚麼是ELISA?
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)最簡單的描述就是
利用抗原/抗體之間的專一性結合反應來得知結果，有分為幾種形式
這次先介紹常用的
https://imgur.com/2f0Feub
(https://tinyurl.com/syg24ed)

a. Sandwitch ELISA
主要用來檢測抗原,以 HIV為例:
(1) 先在檢測用的孔盤上固定抗 HIV的抗體 (Anti-HIV Ab,上圖紫色)
(2) 加入檢體 (血液)，如果裡面有HIV (藍色圓形),則會和 Anti-HIV Ab結合
(3) 洗掉沒結合的，加入另一種 Anti-HIV Ab (從其他動物產生的,這裡以鼠為例,黃色)
(4) 洗掉沒結合的，加入抗鼠抗體(抗黃色的,藍色)的抗體 (從羊產生的)，不過這個
抗體上加了一種酵素 (HRP, 綠色)
(5) 洗掉沒結合的，加入酵素的受質 (Substrate如 TMB, ABTS),受質會被酵素切割產生產物
之後檢測產物就知道結果了

b. Indirect ELISA
主要用來檢測抗體,還是以 HIV為例:
(1) 孔盤上固定 HIV的抗原(上圖藍色)，並加入檢體(血液)
(2) 如果檢體裡有 抗HIV的抗體 (黃色)，則會結合上 HIV的抗原
(3) 洗去未結合的，加入抗人抗體的抗體 (二級抗體,從其他動物產生,藍色)，這抗體有
酵素 (HRP)
(4) 同a.

跟PCR比較:
優點: 檢測量更高(高通量)、比較便宜
缺點: 靈敏度較低，在疾病早期病毒量不高或尚未產生抗體時易偽陰性(測不到)
以 HIV來說，目前的第四代 EIA (ELISA, CMIA)為 Ag/Ab combo
同時檢測 HIV的抗原 (p24)以及抗體 (Anit-TMP Ab)，陽性再以 WB做確認
空窗期(易檢測不到)縮短為 2~3周，但如果使用 RT-qPCR，則可縮短至 7~10天

大概介紹了 ELISA，再來介紹快篩:
快篩常看到的形式是快篩片/棒,除了可以檢測疾病外,驗孕棒也是相似的原理
快篩片所使用的技術叫 Lateral flow assay，是基於免疫色層分析法
(Immunochromatographic test, ICT)
原理其實同樣是抗原/抗體專一性結合反應
常用來檢測的疾病像是流感 (Nucleoprotein)、登革熱 (NS1)、HIV (Anti-HIV Ab)
這邊以登革快篩片做舉例，它可以檢測檢體中登革病毒產生的抗原 NS1
上面分為幾個部分:
a. Conjugate pad: Anti-NS1 Ab(鼠)-膠體金 (Colloidal gold)複合物
b. Test line: 另一種 Anti-NS1 Ab(鼠)
c. Control line: Anti-mouse IgG Ab (羊)

(1) 加入檢體(血液)，帶動 Anti-NS1 Ab前進，如果檢體有 NS1則會和它結合
(2) 移動至 Test line時，會和固定於此的另一種 Anti-NS1 Ab結合，形成
Ab-Ag-Ab 複合物， Test line出現調帶。
(3) 部分的 Anti-NS1 Ab繼續前進至 Control line，和固定於此的羊抗鼠 IgG的抗體
結合 (Anti-mouse IgG Ab)， Control line出現調帶，不論有無NS1，以確保套組正確。

https://imgur.com/GvCH0rF
https://tinyurl.com/rlyus6t
快篩的優點: 超快(30分鐘內)、簡單
缺點: 靈敏度是真的可憐，流感快篩大概只有 50~70%，也就是說有 30~50%機率
測不到 (偽陰性)，同樣的早期病毒量不高或是抗體尚未生成測不到
但畢竟是能快速、簡單且可以大量分配檢測的方法，發展還是必要的

另外我這邊想說一下對於 SARS-Cov-2檢測數次為陰性，之後才陽性以及異常潛伏期的看法
目前來看潛伏期多為 2~14天，通常不會超過6天，卻出現疑似超長潛伏期的患者

1. 操作/試劑問題: SARS-Cov-2是 RNA病毒，使用的 RT-qPCR會先進行 RT轉為 DNA
再進行 DNA擴增，但有做過的人都知道: RNA很怕 RNA水解酶(RNase)，而且
RNase everywhere，空氣中、人和物體表面隨處都有，只要操作清潔不注意不確實
你的樣品就88了，另外檢測套組 (試劑盒)也可能有問題，像是版上的這篇
https://www.ptt.cc/bbs/nCoV2019/M.1581566306.A.F11.html

2. 之後再感染: 其實我覺得這個可能性最高，一般感冒或流感發燒咳嗽很正常
你這時候去驗當然驗不出來，但在這段期間可能被傳染 SARS-Cov-2，過了一長段時間
再檢測測到了，就可以發一篇文說: 可怕狡猾的病毒!潛伏期長達90天，然後就受驚了

3. 這病毒真的很神秘: 這我就不曉得了，那得看後續的研究

總之大概就是這樣，在面臨未來可能無法避免的社區感染，病患多到負壓病房住不下
的危險情況下，希望檢測技術和抗病毒藥物發展能早日控制住疫情。

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 61.230.119.37 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/nCoV2019/M.1582017190.A.9BA.html
推 s505015: Elisa也是要猜coat的量 和稀釋量
→ s505015: 我是不覺得比較簡單
→ s505015: 然後要確定antigen和antibody
推 youngblood: 現在大家才知道檢驗師的重要
推 Kiyoda: 如果是我還是覺得RT 比較準確
推 danms: 我有聽過Elsa
→ batatas: 還有取樣問題 因為是下呼吸道感染為主 咽
推 s505015: 洗完的手法也蠻重要的
→ batatas: 喉採樣要深一點
→ Rinehot: 比起有機合成，我寧可選做生物實驗。
推 pppeko: 取樣很重要 不管後面用ELISA或PCR 再就是
→ pppeko: 抗體的特異性不知夠不夠好
→ pppeko: 個人覺得ELISA有時候結果也會模糊讓人困擾
推 duriamon: 正確。現在靠PCR但是RNA病毒不穩定序列
→ duriamon: 會有變化，必需一邊定序一邊修正primer
→ duriamon: ，另外RNA樣品沒弄好，RNA被RNAse吃光光
→ duriamon: 連驗都沒得驗。目前要等美國CDC驗證完才
→ duriamon: 知道實際偽陽跟偽陰機率如何。按照這個
→ duriamon: 病要反覆檢驗，沒快篩會操死醫檢人員。
推 asdfg012345: 採撿問題啦，對岸猜很多喉頭採撿抹口
→ asdfg012345: 腔就交差了
推 arue: 檢測技術真的很複雜 以及很多問題不好克服
→ arue: 但老百姓聽不進去這麼多
推 hwider: 感謝分享解說！
推 zjin1126: 現在有新的CRISPR/Cas13的技術，可以快
→ zjin1126: 篩病毒核酸，雖然沒有PCR靈敏但是應該
→ zjin1126: 比起檢驗抗體或抗原來的敏感很多
→ zjin1126: https://bit.ly/326zkmI
→ zjin1126: 之前在Zika跟dengu virus的應用算是成
→ zjin1126: 功，應該是蠻有希望的快篩技術
推 hitmd: 樓上的方法也還是要抽RNA,然後兩個溫度反應
→ hitmd: 約要一個小時，其實跟rtqpcr的已經差不多久
→ hitmd: 了，不過蠻新的方式，感謝分享
推 pippen2002: 真得很神蜜啊!!?
→ saimeitetsu: 大三的生物科技學的記憶
→ saimeitetsu: 很吃操作人員的技術，太蔡的人操作
→ saimeitetsu: 都會變成陰性XD
推 cruby841031: 推
推 kinomon: 推
推 lidon00968: 天那 竟然要開課教生物技術
推 cutie: 如果之後要開始檢查抗體的話是不是又要開
→ cutie: 始用westenblot之類的電泳來驗證蛋白質？
推 watase124: western 真的要弄很久 每步都是時間
推 hyc0725zz: 樓下放迪士尼BGM（欸
推 cutie: 但還是以pcr為主 如果後續陰性確定一餓檢
→ cutie: 查抗體可能才需要麻煩的western吧==
→ Amewakahiko: 這板簡直是讓科科的生科人透口氣
推 chungrew: 幫推
→ archlich: 其實台灣應該是全世界檢驗能力密度最高
→ archlich: 的國家，我們有一大堆生科相關的學生，
→ archlich: PCR跟ELISA技術對相關學系的學生來說都
→ archlich: 沒有難度，只要有儀器跟足夠的材料，所
→ archlich: 有相關實驗室都可以投入檢驗
推 mirror0227: 好文推
推 hqu: 又上了一次生物技術
推 boreas224: ELISA要把測試條件抓好要一段時間吧...
→ boreas224: 有文獻有kit的 操作起來當然沒問題
推 boreas224: Loading量、抗體結合時間、呈色時間
→ boreas224: 而且上面也有提到，滿吃操作人員技術的
推 boreas224: 流程看就是那樣，不過操作過程眉角很多
推 t0ny: 推科普文
→ t0ny: 其實醫學分生檢驗真的還蠻需要人的技術，以
→ t0ny: 前遇過不少臨床醫師批評説醫檢師不是就把檢
→ t0ny: 體放到機器上就好了嗎？有什麼難的
→ Amewakahiko: 醫檢師公會會生氣哦 依醫事法及醫檢
→ Amewakahiko: 師法規定 只有醫檢師才能進行臨床檢
→ Amewakahiko: 驗 所以生科繼續科科
→ watase124: 科科只能 for research only QQ
→ pppeko: 檢查抗體就是這篇介紹的ELISA啊 不是weste
→ pppeko: rn blot