Re: [求救] FPLC純化蛋白(補新問題)

[SHARKr1 (毓? ? )]

※ 引述《wizchoco》之銘言：
機型：AKTA avant
Column : HIC

1_sample application
手動injection後會設定高鹽A相去洗loop
這時會有一些雜訊(導電度下降、高UV吸收)，原以為是solvent peak，但不含solvent的
樣品也有此現象，會是空氣跑進column嗎？還是純粹樣品沒binding上去?(但不懂導電度
為何會下降？)，而且收下來測濃度量也不多，有用鹼洗機台和column，但此情形沒改善Q
Q

你可能是設定到用Buffer B去推送樣本了！
機台的設定上原本就會是用buffer A將loop內的樣品推送到column。假設你沒有再做其他
額外的設定的話。導電度的變動應該不會很大。但是你看到導電度下降再加上高UV吸收，
顯然是設定有問題。當然你也可以懷疑是不是有空氣。簡單的確認方法是看一下你的壓力
曲線。是不是壓力很不穩定，如果是的話哪很有可能是進空氣了。接著你應該檢查loop跟
column head的連結是不是確實連結好沒漏氣。

2_Elution流速會影響純化效果嗎?
目前使用流速0.6mL/min實在流太久了，想問流速增加到1-1.2mL/min是否會使binding在c
olumn上的樣品，更容易被洗下來，影響純化效果？

Elution的流速是會影響沒錯，但基本
上他可以再一定的範圍內調整。由於沒有提到你的任何實驗細節（resin種類、管柱內徑
大小、溫度等等），因此很難告訴你有沒有影響。一般來說應該用體積流速去評估是否會
有影響。以1ml的 Hitrap Sepharose FF的膠體來說。這種介質的線性流速建議在100-150
cm/hr上下。一般保險起見都抓在50-75cm/hr。0.6ml/min的體積流速大約在70cm/hr。你
往上調到1.2應該是值得一試。若你不想改，最快的方法是改變平衡跟column wash的速度
。因為這兩步驟影響最小。
==================================

3_回收率
使用手動針筒loading，針筒前端會殘留，injection valve也會有一段殘留
Column用低鹽B相和水洗，UV值都在baseline上，所以應該沒卡在column上
最懷疑的就是injection後A相洗loop的不明雜訊，可是收下來測UV量也沒那麼多
想問還有哪些部分會影響回收率？


針筒的殘留基本上不用太在意。若真的有影響的話表示你的蛋白質太少，禁不起一點點的
損失。也表示你的實驗會很難做....
建議全面跑個膠片，評估一下從lysate到純化後的回收率才好判斷。


4_剛才發生的新問題QQ
樣品injection後，高鹽洗loop時雜訊跑出來，結果UV降不下去還一直飆高(導電度維持正
常值)，以為樣品沒binding上收樣測濃度也很低，目前是先用高鹽把UV洗到baseline，再
繼續跑gradient做Elution，結果如何明天才知道，就是不知道為何UV會突然飆高啊啊啊(
崩潰)


其實我建議你整個方法步驟最好從內建的template去改。會比較好debug
麻煩大家了～～～謝謝～～QQ


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→ Ianthegood: 個人沒用過hic 不過經驗是流速絕對影響 前面那個peak
→ Ianthegood: 大概是pressure peak 回收量低很有可能是你sample loa
→ Ianthegood: d太少
推 july81212: 導電度應該是有殘留低鹽度的buffer在loop loop本身要2
→ july81212: -3倍體積才能完全填充 不過殘留量小不太會影響binding
→ july81212:
推 july81212: 另外調流速前要先看你要的peak分辨度如何 一般會先從g
→ july81212: radient 調完再調整流速部分
推 july81212: 雜訊我想先不管量的問題 洗出時間在injection後 有小
→ july81212: 於2CV 也有可能是unbinding protein 建議跑個膠check
→ july81212: 一下 如果沒有你的target 那就不用太擔心
→ wizchoco: 感謝大大們回答～～loop在使用前都有先用大於5CV的水和
→ wizchoco: 大於5CV的高鹽去洗了
→ wizchoco: 回收率部分，有用低鹽和水去洗，都沒洗出什麼，但用0.1N
→ wizchoco:  NaOH去洗，就有高UV吸收被洗出來
→ wizchoco: 看來是卡在column上QQ
→ Ianthegood: 只能用hic? 要不試試iex?
→ wizchoco: 目前沒辦法換IEX QQ
※ 編輯: wizchoco (123.195.190.114), 01/24/2019 23:42:03
※ 編輯: wizchoco (123.195.190.114), 01/24/2019 23:46:29
推 rasaze: 高鹽有時會造成小鹽塊析出卡在detection cell用大量水溶
→ rasaze: 解洗掉就好，之前做高鹽樣本有遇過，給您參考
推 rickson: 恩
推 windcloud27: 我這邊的業務是教說每次跑完高鹽的buffer後都要用熱
→ windcloud27: 水沖一遍機器                                       用熱水沖機
器一點用都沒有。用純水去洗機會還大一些02/08 23:22

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